Lab 2.0

メガネ

少し前にメガネを変えました。
普通のメガネだとツルの部分が頭を圧迫して頭痛がするので、かけてる感じができるだけないもの・・・と店員さんに注文したところ、シルエットというメーカーを教えていただきました。世界でも一番軽いフレームで、トムクルーズや中田英寿も使ってたとか。たしかに、掛け心地もいいし、軽いし、メガネをかけているということを忘れてしまいそうです。気に入って購入しました。値段が普通のメガネよりもずいぶん高かったのですが、毎日ずっと付けているので、少しぐらいお金をかけてもいいのではないかと、思い切って買いましたが正解でした。おススメのメガネフレームです。

ヒトゲノムを15分で読む

さて、いよいよ2009年も年末に近づき、このブログの更新も滞り・・・、って、言っていてはいけませんので、今年の論文で目にとまったもの今更ながらプレイバックしたいと思います。個人的にはクレイグベンターが新しい生物を作ることを期待していたのですが・・・。

今日の一報は
Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.
Science. 323:133-8. (2009)
です。

最近、FLX, illumina, SOLiD, と次世代シークエンサーの名前を聞くことが多いですが、これらは従来のキャピラリーシークエンサーに比べて読める長さは短いものの、それを超並列化することでトータルの長さを稼いでいます（詳しい比較は幻影随想さん：次世代ゲノムシーケンサの本命は？）。

その次、次々世代シークエンサーということで、一分子でＤＮＡを読むことで、さらに並列化と低コスト化を加速させ、究極的にはヒトゲノムを24時間以内に1000ドル以下で読もう！という目標もあるそうです。ABI 3100の愛用者としては、遠い夢物語ににも思っていましたが、この論文を読んで近い将来、それも5年後や10年後とかにできている可能性は十分にあるなあと思いました。

この方法はPacificBioscience(PacBio)が開発したもので、４色で蛍光標識されたヌクレオチドの中でＤＮＡポリメラーゼ１分子に鋳型の複製をさせれば、合成の際にヌクレオチドがポリメラーゼにトラップされ蛍光が観察されるので、シークエンスがカラーコードとして見える、というものです。このアイディア自体は他のＨｅｌｉＳｃｏｐｅというテクノロジーでも使われているものですが、違う点としてはポリメラーゼのフリーランを見れるところ（HeliScopeでは1塩基読むごとに化学修飾などの時間とコストのかかる操作が必要）で、速く、長く、安くシークエンス出来るということです。


以下、テクニカルな側面を見てみます。

・キーテクノロジー
この1分子シークエンスをするのに重要なブレークスルーとして、
・ZMW(zero-mode-waveguides)
・phospholinked-nucleotide
がありました。

・ZMW(zero-mode-waveguides)
一分子からの蛍光を観察するために必要なのは、今や検出器の感度ではありません（検出器には十分な感度がある）。必要なのはバックグラウンドを低くするための工夫です。
（昼間、星が見えないのは、人間の目の感度が悪いからではありません。夜なら、十分に星を見ることができます。昼間は、星は太陽のバックグラウンドに埋もれて見えないだけです。夜でも都会の空は明るいので、暗い星は見えませんよね。）
ZMWはバックグラウンドの低減に非常に役に立っています。

で、バックグラウンドを低くする工夫として、「励起する領域を小さくする」アプローチがとられます。励起する領域が小さくなると、そこに含まれる見たい蛍光分子（この場合、ＤＮＡポリメラーゼにトラップされた蛍光標識ヌクレオチド）とバックグラウンドのもとになる分子（フリーの蛍光標識ヌクレオチド）の比率は見たい蛍光分子に寄るため、バックグラウンドが低くなります。

この応用として、一分子イメージングに用いられる全反射顕微鏡（TIRFM）とかがあります。TIRFMではエバネッセント場を使うことでカバーグラスから100nm程度しか励起光が当たらない仕組みになっています。しかし、この方法でもバックグラウンドになる分子の濃度が濃くなれば、バックグラウンドは上がることになり、特にＤＮＡポリメラーゼが合成をおこなうのに必要な濃度（~mM）ではバックは高くなってしまいます。

そこで、さらにバックグラウンドを下げるためのアイディアがZMWなのです。

これはTIRFMよりもさらに励起光があたる領域をせまくしたもので、ゼプトリットル（10の-21乗）レベル、つまりカバーグラスの表面スレスレに存在する蛍光分子しか励起されません。例えば1mMの蛍光分子の溶液の場合、この領域に入っている分子の数は・・・
6x10^23x10^-3x10^-21=0.6個
ということで、カバーグラス表面にいるＤＮＡポリメラーゼがトラップした蛍光標識ヌクレオチドが効率よく見えることになります。

さて、どうやってゼプトリットルでしか励起光が当たらないようにしているのか、ということですが、ZMWは励起光の波長よりも小さな穴のメッシュのことです。すると、このメッシュは励起光を通さなくなります。それは、ちょうど電子レンジの窓にマイクロウェーブの波長よりも小さな穴のメッシュが貼ってあるのでこちら側にマイクロウェーブが漏れてこず、自分たちは沸騰せずにすむの同じ原理です。
しかし、メッシュの穴の中にはわずかながら漏れこみます。その漏れこみ具合がちょうどいい具合に界面スレスレでしか起こりません。それでゼプトリットルレベルの励起が可能になっているのです。



・phospholinked-nucleotide
以上の解説で力が尽きてきたのでごく簡単に・・・
従来の蛍光標識ヌクレオチドは塩基が蛍光標識されていたため、それを取りこんでしまうと立体障害のためにＤＮＡ合成がストップしてしまいました。それを利用して電気泳動で分離しているのが普通のシークエンサーの原理なのですが、一分子ＤＮＡポリメラーゼのフリーランを見るには向いていません。また、蛍光色素がDNA鎖に取り込まれてしまうと、これまたバックグラウンドの原因になります。
そこで、3つ並んだリン酸基の端っこに蛍光標識をすると、DNA合成でリン酸基をつなげた際に蛍光標識は脱離していってくれます。また、この標識の場合はDNAポリメラーゼもhappyに合成を続けてくれるようです。だから上の2つの障害は取り除かれたことになります。


上にあげた2つの他にも「どうやって4色の蛍光標識を光学的に分離しているのか？」とか「どうやってＤＮＡポリメラーゼを底面にくっつけるのか？」といった点でもおもしろい技術が使われています。また、このPacBioの方法の以外の一分子シークエンスとして、FRETを使った方法(VisiGen)、ナノナイフと塩基の間のトンネル電流を読む方法(Reveo)、ナノポアを使った方法、などなどあるのですが、それはまた機会があれば・・・

また、PacBioはすでにこの方法を応用してDNAのメチル化の検出やRNAのシークエンスにも成功しており、単一細胞からのDNA・RNAの抽出とくみあわせることで、エピジェネティクスやRNAの解析など、さまざまな研究の質が変わってくると思います。

最後はデータ処理能力か・・・
この方法だと、原理的にはかなりの速い速度でヒトゲノムを読むことができ（PacBIoは2013年までに15分を目指しているとか・・・）、使われれば使われるほどコストも下がっていくことだと思います。本当に1000ドルを切ると、数百万、数千万のゲノムデータが読まれる可能性は十分にあります。すると、問題は、そのデータをどこに貯え、どうやって管理し、どう解析するか、ということになります。どこかで読んだ話、今現在世界中の配列データベースを合わせても数千億塩基程度、ヒトゲノム100人分程度とか。もちろん、個人差のある部分だけを登録すれば1/100程度にはなるだろうし、他にもいろいろやり方はあるだろうが、それを凌駕するデータ量に埋もれてしまう可能性もあるのではないでしょうか？

チキンタツタ

いま、マクドナルドでチキンタツタが復刻していますが、人気のため5日早めに終了とか。
これ、結構好きなんですよね～。なので、昨日と今日は2日連続でチキンタツタを食べてきました。
マクドナルドの中ではかなり好きなメニューではないかな。12月にもう一度復活するらしいので、また食べに行こう。

マジシャンのテニス

昨日は夕方からジャパンオープンテニスを見に行ってきました。
鈴木貴男のテニスを見たのは初めてで、ネットで勝負という、近年珍しいテニスはなかなかおもしろかった！

けど、それ以上におもしろかったのが、今季で引退を表明しているサントロのテニス。この人のプレーを見るのは初めて。名前はなんとなく知っていたけど、どっかの50位くらいの選手、くらいにしか考えていなかったのですが。。。

すごい面白い。

う～ん、あんなテニスをする奴は他にいないよなぁ。
なんでも、サンプラスをしてマジシャンと言わしめたとか。
フォア・バックとも両手打ちで、フォアはスライス。フォロースルーで右手を離すので、左手のバックハンドのようにも見える。このスライス、バックのスライスとはまた少し球筋が違うんですよね。。。回転が結構かかっていて、スピードはそれほど速くはない。けど、ネットすれすれをつたっていく感じ。

ダブルスプレーヤーなのか、配球のプレースメントがすごくいいんですよね。じわじわと追い詰めていく感じ。
ネットプレーもいいし、コートカバーリングもいい。ドカーンと一発、というのはないけど、見ていて非常に面白いテニスでした。

それにしても、この年になるまでサントロのテニスを知らなかったのは不覚・・・。

ノーベル化学賞

・・・そろそろ分子生物学賞にしてはどうだろうか？

ってノーベルの遺言に反するのかな。

フォトンブロック・プロジェクト

Nature Photonicsを見ているとこういうのがあるのを知りました。レゴのパーツを使って安くて簡単に作れて持ち運びに便利な光学実験に使うパーツを作るというものです。いいアイディアですね。レゴで顕微鏡も作れるのでしょうか？？光軸がぶれたりすると厄介なので、あまり精密なのはできないかもしれませんが、簡単な蛍光顕微鏡くらいならできる気がします。実験装置を安くで自分で組めるっていうのはすごいメリットですね。そういえば、googleも最初はサーバーを作るときにレゴを使っていたと聞くし、ここからすごいブレークスルーが生まれるかもしれませんね。

人のふり見て

先週、テニスをしたときにビデオで自分のサーブのフォームを撮ってみることにしました。
う～～ん、思ったよりもカッコ悪いぞ・・・。どうやら脳の中で勝手に理想化しているようですね（笑）。
しかもちょっとフットフォールトしているっぽい（笑）。いままでベースラインの内側に入ってサーブを打っちゃう人をさんざん注意してきましたが、実は自分もそうだったとは・・・！がっくり。

Sorry, Pete...

今更ながらですが、今年のウィンブルドンの男子決勝もスゴかったですね～～～。去年の試合を見ているだけに、今年はあまり期待していなかったのですが、ロディックもフェデラーもいいプレーで、特にファイナルセットは技術だけではない、まさにテニスの神髄を見た気がしました。
驚いたのが、普段はテニスとは無縁のはずの人からも決勝の話を聞いたことでした。研究室のボスからは「最多ゲームなのに試合時間が去年より短かったのはなぜだ？」という研究者らしい（？）質問が。他のラボメンバーも何人も夜中にあの試合を見ていたということでした。見て損はない試合だったと思います。てか見てなきゃ損？？？あの試合、現地で見ていたら鳥肌立っただろうな～～～。間違いなく今年のベストマッチに選ばれるでしょう。

さて、テニスの方はしばらく草トーには出ていないのですが、練習で試合の経験を積んでいます。今の課題はサーブとバックハンド。サーブ＆ボレーに目覚めてから、サーブの大切さを再認識しました。
練習のときと試合の時ってサーブが随分違います（唯一自分のリズムで打てるショットなんですが）。試合のときの方がなぜか確率もよく、ショットもいい。たぶん練習の時よりも十分に時間をかけて間を取るせいなのでしょう。ただ、試合の流れの中では、「とりあえず入れておこう」的なサーブや大切なところのダブルフォールトも結構あるので、改良の余地はありありです（特にメンタル面で）。
バックは練習のときはトップスピンを打つのですが、まだ安定感がないので試合になったらスライスを多用しています。スライスは相手が後ろにいる時には攻撃を受けにくいですが、前に出られるとやはり厳しいものがある。バックのトップスピンを試合に使えるレベルまで引き上げたいですね。

ジャーナルクラブ 神経伝達物質のイメージング

今回は３週間ほど前にScienceに発表された論文。

Fluorescent False Neurotransmitters Visualize Dopamine Release from Individual Presynaptic Terminals
Science 12 June 2009:Vol. 324. no. 5933, pp. 1441 - 1444

神経伝達物質であるドーパンミンやセロトニンの構造を模倣した蛍光物質（FFN511）がトランスポーターによって小胞に取り込まれるというもので、これを利用してプレシナプスからのドーパミンの放出を直接可視化している。
プレシナプスの活動を可視化する方法としては、これまでにFM-dyeやSynapto-pHluorinなどの方法があったが、これらはいずれもシナプス小胞が細胞膜に融合することを検出するものである。なので、はたして膜融合と神経伝達物質の放出を同義としていいのかという問題があったし、可視化された小胞がどういった神経伝達物質を内蔵しているかも分からない場合が多かった。

今回のプローブ（FFN511）はその点、小胞からの伝達物質を直接・特異的に可視化できて、二光子励起でも使用可能ということで、放出だけでなく取り込みも観察したり、シナプス小胞の部分的な融合により放出が起きるのかを検討したり、ドーパミンの放出制御を個々のシナプスで検討したりと、いろいろ実験の夢が広がる。
一方で、はたして本当に内在性のドーパミンとFFN511が同じ挙動をするのか、ドーパミン受容体などに対するサイドエフェクトはないのか、といった批判もあるかと思う。
ただ、この内在性の神経伝達物質を模倣する蛍光プローブを作るというのはいいアイデアだと思うし、このプローブを使わないとできないような実験もたくさんあると思う。将来的に、このアイデアをひろげてグルタミン酸やGABAなんかにも応用できるといいと思う。（が、それは結構難しかもしれない。というのも、ドーパミンのトランスポーターは結構大きな官能基がついていても運搬してくれるが、はたしてグルタミン酸トランスポーターがそれをやってくれるかどうか・・・）

アブストとその日本訳（結構直訳だけど・・・）を載せておく。こうしてみると、日本語にするとなんかかえって分かりづらい・・・。特に最後の一文は本文を読まないと何を言ってるかわからないと思う。

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. In order to observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

神経系はシナプス小胞から放出される神経伝達物質によって神経細胞間のシグナル伝達を行っている。個々のプレシナプスからの神経伝達物質の放出および取り込みを直接可視化するために、モノアミントランスポーターの基質となる蛍光性擬神経伝達物質を設計した。このプローブを用いて線条体におけるドーパミンの放出を可視化し、シナプス可塑性に関する観察を行った。われわれはひとつの刺激に対する神経伝達物質放出の割合は刺激の頻度に依存することを見出した。この実験条件下では速度的に異なる”リザーブ”シナプス小胞の集団は観察されなかった。プレシナプス終末の中に異なる頻度依存性のものが混在していることが、部分的にはD2ドーパミン受容体に依存していることが明らかになった。このことはプレシナプス選択の頻度依存的コーディングのメカニズムに示唆を与えるものである。

ジャーナルクラブ Synthetic biology

さて、しばらく真面目に書いていなかったので、ちょっと真面目に。

木曜日と金曜日は楽しみな日です。それは週刊モーニングが発売されるのと、Cell（隔週）, Nature, Science, Neuron（隔週）といったサイエンスの有名誌が新刊をオンラインで更新するからです。で、特にこの木・金は隔週更新のCell, Neuronが重なる特に楽しみな日。

目をひかれたのがCell onlineに出た

"A synthetic genetic edge detection program"　Tabor et al., Cell 137, 1272 (2009)

です。

最近、Synthetic biologyと呼ばれる分野の論文が、Nature, Nat. biotech, Cellといった有名誌をにぎわせています。これは大腸菌や酵母、場合によっては哺乳類の培養細胞に遺伝子を導入することで、さまざまな機能（光やTNTを検出できるようにしたり、癌を見つけて攻撃できるようにしたり、オシレーターを作ったり）を実現するというもので、医療・産業応用の可能性や、分子の集合体がどうして生命のようなふるまいをするのかを解明するきっかけにもなるかもしれないということで、個人的には注目してます。

で、今回の論文は大腸菌に遺伝子でつくられたプログラムを組み込むことで画像の白黒の境目を検出する（エッジを検出する）機能を持たせらることに成功したというものです。

個々の大腸菌（寒天の上に大量に敷き詰められて培養されている）に組み込まれたアルゴリズムは、

if 光を検出しない then シグナル分子を産生する
if 光を検出する AND シグナル分子を検出する then 色素を産生する

というものです。この2つの命令は実際には遺伝子にコードされたタンパク質によって実現されます。
そうすると、下画像（論文のFig.1参照）のように光が当たっている境界の部分の大腸菌だけが色素を産生することになるので、エッジが検出できるというわけです。


論文中ではこの大腸菌を使って、星型や丸、ヒッチコック監督のシルエットなどのエッジ検出をしています。

これまでのSynthetic biologyの研究の成果から、基本的な論理演算（AND, OR, NOT, SUM）やオシレーターなどが実現できるようになってきました。こうした基礎演算を組み上げて、さらに複雑な機能を実現させることができるか？というところが今の課題になっています(Purnick and Weiss Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 410 (2009))。今回の論文はそういう意味でより複雑な処理を実現した例といえると思います。

一方で、これからもっと複雑な機能を作るときに、ひとつひとつ試すのも大変なので、シミュレーション予測によるデザイン設計やハイスループットスクリーニングによる進化が必要になってくると思います。それでどこまで複雑なものを作れるようになるか、まさに挑戦ですね。